厭氧微生物在自然界中分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。由于它們不能代謝氧來進一步生長，且多數情況下氧氣分子的存在對其有害，所以在進行分離、培養時必須處于去除氧的環境下。分離和培養厭氧菌的方法很多，堿性焦性沒食子酸法是操作比較簡單的方法之一。焦性沒食子酸與堿溶液NaOH作用后形成易被氧化的堿性沒食子鹽，它能通過氧化作用除掉密封容器中的氧氣。
菌種：巴氏芽孢梭菌（一種厭氧菌）、熒光假單胞菌。
培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。
溶液或試劑：焦性沒食子酸、10%NaOH溶液，滅菌的石蠟凡士林等。
儀器或其他用具：滅菌脫脂棉、滅菌的培養皿和培養皿蓋等。
請完成下列實驗步驟及相關問題：
（1）用滅菌完成的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基進行

倒平板

倒平板

（填操作步驟），待培養基凝固稍干燥后，在平板上最好采用

平板劃線

平板劃線

法一半接種巴氏芽孢梭菌，另一半接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號筆作好標記。
（2）滴加10%NaOH溶液約2mL于焦性沒食子酸上，切勿使溶液溢出脫脂棉，立即將

已接種的平板

已接種的平板

覆蓋于培養皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，目的是既可以使堿性沒食子鹽充分去除氧氣，又防止

培養皿和皿蓋出現較大縫隙導致氧氣和雜菌進入

培養皿和皿蓋出現較大縫隙導致氧氣和雜菌進入

，除此之外，焦性沒食子酸反應物不能與培養基表面接觸。最后，以溶化的石蠟凡士林液密封培養皿與皿蓋的接觸處，置30℃培養，定期觀察平板上菌種的生長狀況并記錄。
（3）在進行厭氧培養時，同時接種熒光假單胞菌，它是一種

好氧

好氧

菌，目的是監測容器內的氧氣環境。
（4）各種厭氧微生物對氧的耐受能力有所不同。以下是采用深層瓊脂法（培養基不同深度含氧量不同）探究某種厭氧菌的耐氧能力實驗：
用無菌生理鹽水，制成菌懸液。將裝有葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基的試管置于100℃水浴中溶化并保溫5～10min。將試管取出后，室溫靜置冷卻至45～50℃時，無菌操作吸取0.1mL細菌懸液加入試管中，雙手快速搓動試管（如圖），目的是

使菌種均勻分布于培養基中

使菌種均勻分布于培養基中

，不采用震蕩是避免達到目的的同時有過多的空氣混入培養基。之后將試管置于冰浴中，使培養基迅速凝固。將上述試管置于28℃溫室中靜置保溫48h后開始連續進行觀察，直至結果清晰為止，根據

細菌在試管中的生長部位

細菌在試管中的生長部位

來判斷細菌的耐氧能力大小。