野生型黑麥草細胞壁中較高的木質素含量會降低其作為青儲飼料的品質。D蛋白是催化木質素合成的關鍵酶，某研究小組通過構建含D基因部分序列正、反向片段的表達干擾載體（如圖所示），在細胞內產生雙鏈RNA分子，誘導D基因的mRNA持續降解，培育得到低木質素含量的黑麥草。

（1）D基因的正、反向目的片段的克隆：提取野生型黑麥草葉片全部mRNA，

逆轉錄

逆轉錄

成cDNA。根據cDNA序列選取合適的片段，分別設計正、反向目的片段的上下游引物，正向片段和反向片段引物的擴增序列

相同

相同

（相同/不同），酶切位點

不同

不同

（相同/不同），以使目的片段定向插入載體的特定位置。擴增產物經

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

，切下目的條帶回收后與載體連接，形成克隆載體以用于正、反目的片段的擴增。
（2）構建D基因的表達干擾載體：
Ⅰ．對含有正向片段的克隆載體和反向片段的克隆載體分別進行雙酶切，將回收片段與經相同酶切的中間載體用

DNA連接酶

DNA連接酶

酶進行連接，獲得含有干擾片段的重組中間載體；為使干擾片段能在受體細胞中復制，中間載體需有

復制起點

復制起點

。
Ⅱ．將干擾片段和超表達啟動子插入Ti質粒的

T-DNA

T-DNA

得到D基因的表達干擾載體，插入超表達啟動子的目的是

促進正、反向目的片段（干擾片段）的轉錄，得到足量的相應RNA分子

促進正、反向目的片段（干擾片段）的轉錄，得到足量的相應RNA分子

。
（3）導入和培養：將D基因的表達干擾載體導入農桿菌。黑麥草愈傷組織在菌液中浸沒5min,先置于無菌濾紙上吸去多余的菌液，再轉入無菌水浸潤的濾紙上共培養3天，共培養的目的是

使攜帶干擾片段（目的片段）的T-DNA整合到受體細胞（黑麥草愈傷組織細胞）染色體DNA上

使攜帶干擾片段（目的片段）的T-DNA整合到受體細胞（黑麥草愈傷組織細胞）染色體DNA上

。篩選得到的愈傷組織經

再分化

再分化

過程，培育得到再生植株。
（4）鑒定和篩選：對轉基因植株與

野生型（或非轉基因）

野生型（或非轉基因）

植株進行木質素含量測定與分析，篩選保留木質素含量顯著

降低

降低

的植株。