科學家應用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，為解決我國糧食問題做出了重要貢獻。若測得某耐旱基因（mt1D）編碼鏈首端到末端（其中一條鏈）的序列為5'-ATCTACGCGCTCATCCG …（省略3n個核苷酸序列）……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如圖1為構建重組質(zhì)粒的過程示意圖，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ為限制酶（四種酶的識別序列詳見表），箭頭表示轉錄方向。回答下列問題：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
識別序列及切割位點（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

?
（1）為獲取更多mtlD基因，可采用PCR技術擴增，在反應體系中除加入引物、dNTP、緩沖液、Mg²⁺外，還需要加入

模板、耐高溫的DNA聚合酶

模板、耐高溫的DNA聚合酶

。某同學設計了如下六種PCR引物，其中適合選用的一對引物是

②④

②④

（選填序號）。
①5′-GACTACTCGCGCATCTA-3′
②5′-ATCTACGCGCTCATCCG-3′
③5′-GCGATGAGTAACGACGC-3′
④5′-CGCTACTCATTGCTGCG-3′
⑤5′-TAGATGCGCGAGTAGGC-3′
⑥5′-CGCAGCAATGAGTAGCG-3′
（2）若PCR反應得到的非特異性擴增產(chǎn)物偏多，從引物設計和溫度控制角度考慮，主要原因可能是

退火溫度低，引物設計不恰當

退火溫度低，引物設計不恰當

。
（3）為將圖中質(zhì)粒A和mtlD基因正確連接構建重組質(zhì)粒B，設計mtlD基因的引物時，在兩種引物的5′端分別添加

BamHⅠ、SmaⅠ

BamHⅠ、SmaⅠ

限制酶的識別序列，選用

BclⅠ、SmaⅠ

BclⅠ、SmaⅠ

限制酶切割質(zhì)粒A，酶切后的載體和目的基因片段通過

T₄DNA連接

T₄DNA連接

酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了篩選出轉入了重組質(zhì)粒的受體細胞，應首先在篩選平板培養(yǎng)基添加

四環(huán)素

四環(huán)素

，再將平板上長出的菌落通過影印平板法接種到添加

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的平板培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)觀察。
（4）若從平板上長出的菌落中提取重組質(zhì)粒B利用Sau3AⅠ進行完全酶切，最多可以得到

3

3

種大小不同的DNA片段。
（5）圖2是對重組質(zhì)粒測序的部分序列，若目的基因與質(zhì)粒正確連接，則圖中M連接處的序列正確的是

Q3

Q3

，填序列編號）。