現代生物技術。
吡哆醛激酶（PLK）是維生素B₆的關鍵代謝酶，某研究團隊構建了含家蠶PLK基因的重組質粒，導入大腸桿菌誘導表達，對所得的產物進行分離純化。
重組質粒的構建選用了pET-22b（+）質粒，圖1為該質粒一條鏈的部分序列。各限制酶的識別序列、DNA序列所對應的氨基酸序列均已在圖中標注。

（1）DNA分子中與mRNA序列一致的鏈稱為編碼鏈，與mRNA序列互補的鏈稱為模板鏈。氨基酸Met的密碼子是AUG，由此可知圖1所示為

編碼鏈

編碼鏈

（編碼鏈/模板鏈）。
（2）該團隊將家蠶PLK基因作為目的基因（圖2），兩端的序列已于圖中標注。為了將圖2所示目的基因插入圖1所示的質粒序列，應選用的限制酶是

B

B

。
A.NdeⅠ和HindⅢ
B.NdeⅠ和XhoⅠ
C.SalⅠ和HindⅢ
D.SalⅠ和XhoⅠ
（3）pET-22b（+）質粒含有氨芐青霉素的抗性基因，該質粒的pelB leader序列可將表達的目的蛋白分泌到細胞外。若按照第（2）題所選的限制酶進行預定操作，下列分析正確的是

BD

BD

。（多選）
A.應選用具有氨芐青霉素抗性的大腸桿菌作為受體菌
B.應選用不具有氨芐青霉素抗性的大腸桿菌作為受體菌
C.大腸桿菌所表達的目的蛋白會被分泌到細胞外
D.大腸桿菌所表達的目的蛋白不會被分泌到細胞外
（4）通過上述方法在大腸桿菌中表達出的吡哆醛激酶，其肽鏈在羧基端有連續6個氨基酸His（His?Tag），可利用His?Tag與Ni²⁺之間的親和層析加以純化。此步操作應于何時進行

C

C

。
A.破碎細菌后，過濾前
B.過濾后，加入硫酸銨前
C.加入硫酸銨后，冷凍結晶前
D.冷凍結晶后
（5）若以上述工藝流程大規模生產吡哆醛激酶，涉及生物工程的領域有

ACD

ACD

。（多選）
A.基因工程
B.細胞工程
C.發酵工程
D.酶工程