真核細胞內存在的聚合酶θ（Polθ）在修復斷裂DNA中發揮重要作用，但該過程極易出現突變，Pol日基因在大多數組織細胞中不表達，但在許多癌細胞中高表達，促進癌細胞增殖。為研究（Polθ）的功能，科學家開發了綠色熒光蛋白（GFP）報告基因檢測法，原理如圖1實驗組1所示，甲為GFP基因左半部的部分放大。在此基礎上，將實驗組1中甲替換為乙，導入受體細胞，記為實驗組2，觀察到兩組細胞均發出綠色熒光。

（1）斷裂DNA修復過程中極易出現突變的原因可能有

ABD

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A.微同源區的結合造成斷裂部位堿基對缺失
B.延伸微同源區的3′端時，堿基對錯配引起基因突變
C.Polθ在催化DNA延伸過程中不遵循堿基互補配對原則
D.將不同來源的DNA片段連接在一起，引起DNA序列改變
（2）簡述實驗組2的細胞發綠色熒光的機制

形成完整GFP基因過程中，引入突變的轉錄模板鏈被切除，Polθ以非轉錄模板鏈片段的正確序列為模板，使合成的轉錄模板鏈中原引入的編碼終止密碼子序列被正確序列替換，表達出正確的GFP蛋白

形成完整GFP基因過程中，引入突變的轉錄模板鏈被切除，Polθ以非轉錄模板鏈片段的正確序列為模板，使合成的轉錄模板鏈中原引入的編碼終止密碼子序列被正確序列替換，表達出正確的GFP蛋白

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（3）科學家對農桿菌Ti質粒進行改造，改造后的Ti質粒的部分序列如圖2所示。轉入玉米細胞后，gRNA能夠與玉米細胞DNA特定位點結合，從而引導Cas9蛋白在此位點斷開DNA，HR1和HR2分別與玉米DNA切斷位點兩側序列同源，玉米細胞在Polθ的參與下實現外源片段插入。圖2中插入玉米染色體的片段能穩定表達和擴增，其他區域的基因只能瞬時表達且無法擴增。
注：HRA為抗除草劑基因，NPTⅡ為卡那霉素抗性基因
①在轉化過程中，使用改造后的Ti質粒的優點是

能夠在特定位點插入基因片段

能夠在特定位點插入基因片段

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②標記基因插入轉基因作物染色體中往往會影響植物的生長發育，并帶來環境安全隱患。現要制備轉耐寒CXE-20基因的玉米，請利用該方法設計Ti質粒相關序列（以圖2形式表示，并填入代表相關基因的字母）
a、Cas9   b、gRNA    c、HRA     d、NPTII    e、CXF-20    f、HR1    g、HR2
（4）啟動子和增強子是基因中與基因表達相關的區域，轉錄因子可通過與啟動子和增強子結合，調控基因的表達。科研人員開發基因表達調控體系：轉錄因子復合物（gRNA-dCas9-轉錄因子）。利用該體系，對兩種細胞的同一基因的表達進行調控，得到下表結果（數字為表達量相對值）。據表可知，對兩種細胞的該基因均能提高表達量的gRNA結合位置為

啟動子+增強子h

啟動子+增強子h

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gRNA結合位置 細胞種類	啟動子	啟動子+增強子u	啟動子+增強子h
M細胞	60	85	95
N細胞	20	18	30

（5）綜合上述信息，可為研發治療癌癥新藥提供的借鑒思路為

設計轉錄因子復合物降低Polθ基因的表達量

設計轉錄因子復合物降低Polθ基因的表達量

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