研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子是組件式蛋白質(zhì)，包括DNA結(jié)合功能域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（DNA-AD），兩結(jié)合域分開(kāi)時(shí)具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，如果將待測(cè)蛋白質(zhì)X與DNA-BD融合，蛋白質(zhì)Y與DNA-AD融合，蛋白質(zhì)X和Y有相互作用時(shí)，兩結(jié)構(gòu)域能重新呈現(xiàn)完整轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活報(bào)告基因啟動(dòng)子，過(guò)程如圖1所示。科研人員為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)X和Y是否具有相互作用及作用位置是位于蛋白質(zhì)的氨基端還是羧基端，分別PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)X和Y的全長(zhǎng)基因序列、編碼氨基端603個(gè)氨基酸片段的基因序列、編碼羧基端539個(gè)氨基酸片段的基因序列，分別構(gòu)建不同的酵母表達(dá)載體（如圖2和圖3所示），其中Amp^r為氨芐青霉素抗性基因，His3和TRPI分別為控制組氨酸和色氨酸合成的基因。空白載體或單獨(dú)一種載體均不能激活報(bào)告基因，載體對(duì)酵母菌無(wú)毒害作用。回答下列問(wèn)題：

（1）為了將pLexA-JL和pB42AD載體分別與蛋白質(zhì)X和Y的三種基因序列連接，需要先進(jìn)行PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)X基因和蛋白質(zhì)Y基因的6種序列，共需要設(shè)計(jì)

8

8

種引物；擴(kuò)增后再用限制酶

EcoR I、BamH I

EcoR I、BamH I

和

EcoR I、Xho l

EcoR I、Xho l

分別切割蛋白質(zhì)X基因的3種序列和Y基因的3種序列。構(gòu)建好pLxA-JL和pB42AD基因表達(dá)載體后，為確定是否成功，需要酶切兩種載體后，根據(jù)

電泳

電泳

結(jié)果觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目標(biāo)條帶。
（2）色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌菌株是實(shí)驗(yàn)室常用的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，將成功構(gòu)建的上述基因表達(dá)載體通過(guò)

Ca²⁺處理法

Ca²⁺處理法

法導(dǎo)入到處于感受態(tài)的色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌中，在培養(yǎng)基中需添加

氨芐青霉素

氨芐青霉素

用于篩選成功導(dǎo)入基因表達(dá)載體的酵母菌。
（3）兩種載體成功導(dǎo)入酵母并表達(dá)，結(jié)果為蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y、蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y、蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y羧基端、蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y羧基端之間有相互作用。據(jù)此可推測(cè)的結(jié)論是

蛋白質(zhì)X和Y之間具有相互作用，X蛋白和Y蛋白作用位置在羧基端

蛋白質(zhì)X和Y之間具有相互作用，X蛋白和Y蛋白作用位置在羧基端

。不同蛋白質(zhì)之間相互作用是通過(guò)檢測(cè)

報(bào)告基因的表達(dá)（或LacZ的表達(dá)）

報(bào)告基因的表達(dá)（或LacZ的表達(dá)）

得到的。