四環素被廣泛應用于治療人及動物的細菌感染，但殘留在動物組織、奶制品中的四環素通過食物鏈進入人體，會對人類健康造成威脅。為保障食品安全和人類健康，科研人員向大腸桿菌體內導入了一些特殊的DNA序列作為生物傳感器，從而建立一種簡易、靈敏以及準確的四環素檢測方法。
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（1）研究者利用如圖1所示的原理設計四環素檢測傳感器（圖中GFP為綠色熒光蛋白基因）。當環境中有四環素時，菌體

能

能

（填“能”或者“不能”）發出綠色熒光，原因是

四環素能解除R蛋白對啟動子B的抑制作用

四環素能解除R蛋白對啟動子B的抑制作用

。因此可以通過檢測熒光強弱來判定環境中的四環素濃度。
（2）研究者利用基因工程技術構建含四環素檢測傳感器的大腸桿菌工程菌。
①利用如圖2所示的質粒1和質粒2，構建同時含片段1和片段2的表達載體，可用限制酶E、X和

E、S

E、S

分別處理質粒1和質粒2，再用DNA連接酶連接。（四種限制酶的識別序列及切割位點如下表所示）

限制酶	E	X	S	P
識別序列及切割位點	5′…G↓AATTC…3′ 3′…CTTAA↑G…5′	5′…T↓CTAGA…3′ 3′…AGATC↑T…5′	5′…A↓CTAGT…3′ 3′…TGATC↑A…5′	5′…CTGCA↓G…3′ 3′…G↑ACGTC…5′

②研究者通過上述方法將所有的啟動子和相應基因的DNA片段與載體連接，構建表達載體，導入用

CaCl₂

CaCl₂

處理的大腸桿菌細胞內。經過篩選，獲得工程菌。
（3）研究者發現在四環素濃度較低時，隨四環素濃度增加，工程菌的熒光強度變化不明顯。欲獲得檢測靈敏度更高的傳感器，參照（1）中的原理圖，從以下選項中選擇啟動子和基因，構建表達載體并轉入大腸桿菌后篩選，則啟動子和基因最合適的組合應為①A②

C

C

③

D

D

，該組合檢測靈敏度更高的原因是

添加T7基因，可表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高，可增強相關基因的表達，sfGFP基因，表達熒光強度和穩定性較高綠色熒光蛋白，進而增強檢測的靈敏度。

添加T7基因，可表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高，可增強相關基因的表達，sfGFP基因，表達熒光強度和穩定性較高綠色熒光蛋白，進而增強檢測的靈敏度。

。
Ⅰ.啟動子：
①啟動子A
②啟動子B
③經T7RNA聚合酶特異性誘導開啟的啟動子
Ⅱ.基因：
A.R基因
B.GFP基因
C.T7基因（表達T7RNA聚合酶，其活性比大腸桿菌RNA聚合酶更高）
D.sfGFP基因（表達熒光強度和穩定性都高于GFP的綠色熒光蛋白）