定點誘變技術是近年來生物工程研究中發展迅速的一個領域。通過定點誘變可以在體外改造目的DNA分子，進而研究基因的表達以及蛋白質的結構與功能之間的關系。經典的大引物PCR定點誘變技術成為基于PCR的定點誘變技術中應用最普遍的方法，操作過程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導入大腸桿菌的質粒中保存，該質粒含有氨芐青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點，結構如圖乙?；卮鹣铝袉栴}：

（1）利用大引物PCR進行定點誘變需要進行兩輪PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要

2

2

個循環才能獲得相應的大引物模板。在PCR2中，要獲得帶有誘變點的改良基因，引物應選用大引物兩條鏈中的

②

②

（填“①”或“②”）。
（2）為實現質粒和改良基因的高效連接，選用限制酶XmaⅠ而不選用限制酶SmaⅠ的原因是

SmaⅠ的酶切末端為平末端，無法與改良基因上的黏性末端連接

SmaⅠ的酶切末端為平末端，無法與改良基因上的黏性末端連接

。為將改良基因構建在質粒上，還需要

BgiⅡ、DNA連接酶

BgiⅡ、DNA連接酶

等酶。
（3）在構建改良基因表達載體時，有的質粒含有改良基因，有的質粒為空白質粒，將含上述元件的溶液加入到大腸桿菌菌液中，適宜溫度下培養一段時間后，再將菌液涂布在含氨芐青霉素和

β-半乳糖苷

β-半乳糖苷

的平板上。一段時間后，在培養基上出現白色和藍色兩種菌落，其中白色菌落含有重組質粒，判斷的依據是

構建改良基因重組質粒時破壞了LacZ基因，含該質粒的大腸桿菌不能分解β-半乳糖苷產生藍色物質，菌落為白色

構建改良基因重組質粒時破壞了LacZ基因，含該質粒的大腸桿菌不能分解β-半乳糖苷產生藍色物質，菌落為白色

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