1965年中國科學家人工合成了具有生物活性的結晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質的桂冠。人胰島素基因表達的最初產物是一條肽鏈構成的前胰島素原，經圖1所示的過程形成具生物活性的胰島素。此后科學家又提出了利用基因工程改造大腸桿菌生產人胰島素的兩種方法：AB法是根據胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；BCA法是利用胰島B細胞中的mRNA得到胰島素基因，表達出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段。這兩種方法使用同一種質粒作為載體。請據如圖分析并回答下列問題：

（1）由于密碼子具有

簡并性

簡并性

，AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。

AB和BCA

AB和BCA

（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法獲取的目的基因中不含人胰島素基因啟動子。
（2）圖2是利用基因工程生產人胰島素過程中使用的質粒及目的基因的部分結構。為使目的基因與載體正確連接，在設計PCR引物時可添加限制酶

XhoⅠ和MunⅠ

XhoⅠ和MunⅠ

的識別序列。通過上述方法獲得人的胰島素基因后，需要通過PCR技術進行擴增，已知胰島素基因左端①處的堿基序列為-CCTTTCAGCTCA-，則其中一種引物設計的序列是5′

-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-

-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-

3′。
（3）β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。經

鈣離子處理法

鈣離子處理法

（處理方法），大腸桿菌與重組質粒混合培養一段時間后，將大腸桿菌接種到添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上篩選出

白

白

色的菌落即為工程菌種。
（4）科學家利用蛋白質工程技術，研制出了賴脯胰島素，與天然胰島素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。獲得賴脯胰島素基因的途徑是：從預期的蛋白質功能出發→

設計預期的蛋白質結構

設計預期的蛋白質結構

→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列。