如圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草的培育流程，①②③④表示過程，其中②表示利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。回答下列相關(guān)問題：

（1）在①過程構(gòu)建重組質(zhì)粒時，若用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理Ti質(zhì)粒和含目的基因的DNA片段，使兩者形成粘性末端用于拼接，這種方法的明顯缺點(diǎn)是目的基因和質(zhì)粒

反向連接、自身環(huán)化

反向連接、自身環(huán)化

（答出2點(diǎn)即可）。另外，影響拼接效率的主要因素，除以上缺點(diǎn)和鹽離子濃度、滲透壓、溫度等環(huán)境因素外，還有

目的基因的濃度、質(zhì)粒的濃度、酶的濃度、反應(yīng)時間等

目的基因的濃度、質(zhì)粒的濃度、酶的濃度、反應(yīng)時間等

（答出2點(diǎn)即可）。
（2）在②過程中，將圖示重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌時，可用

氯化鈣（Ca²⁺）

氯化鈣（Ca²⁺）

處理農(nóng)桿菌，以提高轉(zhuǎn)化效率。操作之后，需要特定的培養(yǎng)基對農(nóng)桿菌進(jìn)行篩選，其原因是

不是所有的農(nóng)桿菌都接納重組質(zhì)粒

不是所有的農(nóng)桿菌都接納重組質(zhì)粒

，最終篩選到的對象在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基上的存活情況是

在四環(huán)素培養(yǎng)基上存活，在含青霉素培養(yǎng)基上死亡

在四環(huán)素培養(yǎng)基上存活，在含青霉素培養(yǎng)基上死亡

。
（3）在③過程常通過調(diào)節(jié)植物激素的適當(dāng)配比，從愈傷組織誘導(dǎo)出胚狀體或根芽，并由此再生出新植株。愈傷組織特點(diǎn)

排列疏松、無規(guī)則、薄壁細(xì)胞、分生能力強(qiáng)

排列疏松、無規(guī)則、薄壁細(xì)胞、分生能力強(qiáng)

（寫出兩點(diǎn)）
（4）為誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽，通常應(yīng)在培養(yǎng)基中加入兩類植物激素，其中起主要作用的是

細(xì)胞分裂素

細(xì)胞分裂素

。