PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：
（1）為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA，再經 逆轉錄逆轉錄過程得到cDNA，將其作為PCR反應的模板，并設計一對特異性引物來擴增目的基因。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入 ECORⅠECORⅠ和 PstⅡPstⅡ兩種不同限制酶的識別序列。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用 T4DNA連接酶T4DNA連接酶（填“E.coli DNA連接酶”或“T4DNA連接醇”）。
相關限制酶的識別序列及切割位點
| 名稱 | 識別序列及切割位點 | 名稱 | 識別序列及切割位點 |
| HindⅢ | A↓AGCTT TTCGA↑A |
ECORⅠ | G↓AATTC CTTAA↑G |
| PstⅡ | CAG↓CTG GTC↑GAC |
PstⅠ | CTGC↓AG GA↑CGTC |
| KpnⅠ | G↓GTACC CCATG↑G |
BamHⅠ | G↓GATCC CCTAG↑G |
（3）轉化前需用caCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于
感受態
感受態
的生理狀態，以提高轉化效率。（4）將轉化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養基上進行培養，隨機挑取單菌落（分別編號為1、2、3、4）培養并提取質粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如圖2，
3
3
號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細胞培養液中，培養24小時后，檢測處于細胞周期（示意圖見圖3）不同時期的細胞數量，統計結果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖可能的原因是將細胞阻滯在細胞周期的
G2/M
G2/M
（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。【考點】細胞增殖的意義和細胞周期．
【答案】逆轉錄；ECORⅠ；PstⅡ；T4DNA連接酶；感受態；3；G2/M
【解答】
【點評】
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發布：2024/6/27 10:35:59組卷：341引用：3難度：0.6
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1．細胞從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期，以下為細胞周期的幾種檢測方法，分析回答相關問題。
（1）BrdU滲入測定細胞周期的方法：BrdU加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料。若 DNA-條單鏈滲入了BrdU時，染色體表現為深色，若DNA兩條單鏈均滲入了BrdU時，染 色體表現為淺色。細胞如果處于第一個周期的中期，則細胞中每條染色體均有條單體為深色。細胞如果處于第三個周期的中期，則由同一細胞分裂所得所有細胞中全部染色體中，兩條單體均為淺色的染色體占的比例為。統計分裂中各期比例，就可算出細胞周期的值。
（2）同位素標記法測定細胞周期：為測定某種細胞分裂的細胞周期，利用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸短暫培養該種細胞一段時間后，處于S期的細胞都會被標記。洗脫含放射性同位素的胸腺嘧啶脫氧核苷酸，再換用無放射性的新鮮培養液培養，定期檢測。不同間隔時間取樣，結果如圖1所示。
A：處于S期的細胞都被3H標記；B：被標記細胞最早進入分裂期；C：50%分裂期細胞被標證且在增加；D：50%分裂期細胞被標記且在減少；E：出現被標記細胞第二次進入分裂期。則這種細胞的S期為h。
（3）流式細胞儀PI染色法：由于細胞周期各時相的DNA含量不同，PI可以與DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內DNA含量送行檢測，可以將細胞周期各時期區分開來，獲得流式DNA含量圖進而計算出細胞周期的值。
圖2為某二倍體生物（2N）細胞周期測定所得流式DNA含量圖，圖中b點對應的細胞染色體數目為（填“2N”、“4N”或“2N或4N”），與對照組相比，實驗組可能是經過了處理（填“DNA合成抑制劑”或“秋水仙素”）。發布：2025/1/3 8:0:1組卷：52引用：1難度：0.5 -
2．細胞周期包括分裂間期（分為G1期、S期和G2期）和分裂期（M期）。如圖1標注了甲動物腸上皮細胞的細胞周期各階段的時長及DNA含量。圖2為用某抗癌藥物處理體外培養的該動物的癌細胞，24小時后用液式細胞儀（可根據細胞中DNA含量的不同對細胞分別計數）的檢測結果。請回答下列問題：
（1）乙動物腸上皮細胞的細胞周期時長為24 h,M期時長為1.9 h。若要在顯微鏡下觀察細胞有絲分裂過程中染色體形態的變化，選用（填“甲”或“乙”）動物腸上皮細胞更合適。原因是。
（2）乙圖中a峰和b峰之間的細胞正處于（填“G1”、“S”、“G2”、“M”）期。由圖乙可推測抗癌藥物抑制癌細胞增殖的機理可能是抑制了過程。
（3）細胞癌變的根本原因是。
（4）若用含放射性同位素的胸苷（DNA復制的原料之一）短期培養甲動物腸上皮細胞后，處于S期的細胞都會被標記。洗脫含放射性同位素的胸苷，換用無放射性的新鮮培養液培養，定期檢測。預計最快約h后會檢測到被標記的M期細胞。
（5）若向甲動物腸上皮細胞培養液中加入過量胸苷，處于S期的細胞立刻被抑制，而處于其他時期的細胞不受影響。預計加入過量胸苷約h后，細胞都將停留在S期。發布：2025/1/15 8:0:2組卷：18引用：1難度：0.6 -
3．細胞周期同步化是指利用一定方法使細胞群體處于同一細胞周期同一階段的過程。如圖是動物細胞周期同步化的方法之一，G1、S、G2、M期依次分別為10h、7h、3.5h、1.5h。使用DNA合成抑制劑選擇性阻斷S期，去除抑制劑后S期可繼續進行，從而實現細胞周期同步化。下列敘述錯誤的是（ ）
發布：2024/12/31 0:0:1組卷：11引用：3難度：0.7
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