水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一種蛋白質，是一種優良的凝血酶抑制劑，在血栓治療上有著重要的醫學價值。已知天然水蛭素的抗凝血活性較低，產量和來源有限，某科研團隊擬通過一定的技術手段改造水蛭素基因，通過制備山羊乳腺生物反應器獲得活性高、產量大的重組水蛭素。
回答下列問題：
（1）水蛭素基因的改造：研究發現，水蛭素的第47位天冬酰胺替換為賴氨酸，可以提高其活性。通過建立功能與結構的聯系，運用

蛋白質

蛋白質

工程對水蛭素分子進行改造：從預期的水蛭素功能出發，設計水蛭素的

空間結構

空間結構

，推測出其氨基酸序列，再依據

中心法則/mRNA序列/核糖核苷酸序列

中心法則/mRNA序列/核糖核苷酸序列

推測出水蛭素基因的核苷酸序列，進而運用基因定點突變技術改造水蛭素基因。
（2）水蛭素基因表達載體的構建：應用PCR技術對改造后的水蛭素基因進行擴增，在設計引物時，應在引物5'端添加特定限制酶的識別序列，其目的是

便于將水蛭素基因與載體連接

便于將水蛭素基因與載體連接

。將水蛭素基因和表達載體用

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

酶處理獲得重組DNA分子。
（3）山羊成纖維細胞的培養、轉化：將無菌條件下采集制備的

雌性

雌性

（填“雌性”或“雄性”）山羊成纖維細胞懸液作為初始材料進行

原代

原代

培養。培養一段時間后，加入胰蛋白酶使細胞松散，當貼壁細胞趨于球形時加入過量新鮮培養液，目的是

終止（緩解）酶解反應

終止（緩解）酶解反應

。將帶有重組DNA分子的脂質體與成纖維細胞共培養，獲得含有目的基因的受體細胞。應用PCR技術可精準鑒定受體細胞中是否導入了水蛭素基因，若PCR反應出現無擴增條帶的假陰性結果，可能的原因有哪幾項？

ABC

ABC

。
A.反應溫度不適宜
B.引物量不夠
C.模板量不夠
D.重組DNA未導入
（4）轉基因奶山羊的克隆：將成功轉化的成纖維細胞的核取出，移入去核的

卵母/卵/受精卵

卵母/卵/受精卵

細胞中，用電刺激后進行胚胎體外培養，將早期胚胎移植到經

同期發情

同期發情

處理的代孕母子宮內，經妊娠、分娩獲得轉基因克隆奶山羊。
（5）重組水蛭素的獲取和檢測：收集轉基因奶山羊乳汁，從中提取得到

蛋白質

蛋白質

，分子水平上采用

抗原抗體雜交

抗原抗體雜交

技術鑒定是否含有重組水蛭素，最后使用離子交換層析實現重組水蛭素的

分離（純化）

分離（純化）

。