PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（注：箭頭表示切割位點(diǎn)）

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTC CTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACC CCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCC CCTAG↑G

（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA經(jīng)RT-PCR獲得大量的目的基因，該過(guò)程使用到的酶有

逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶

逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶

。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端需添加

ECORⅠ

ECORⅠ

和

Pvit II

Pvit II

兩種限制酶的識(shí)別序列。雙酶切避免了目的基因與載體的

反向

反向

連接，同時(shí)減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接，以提高重組質(zhì)粒的比例。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，需使用的酶是

DNA連接酶

DNA連接酶

。
（3）轉(zhuǎn)化前需用CaCl₂處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于

感受

感受

態(tài)的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，

3

3

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)處于細(xì)胞周期（圖3）不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原因是：將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的

G₂/M

G₂/M

（填“G₁”或“S”或“G₂/M”）期。