In-Fusion技術是一項新型的無縫克隆技術。該技術關鍵是要在目的基因兩端構建與線性化質粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15-20bp），然后用In-Fusion酶處理即可實現無縫連接。它的操作步驟大致為：①利用PCR技術將質粒線性化；
②PCR擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因；
③目的基因與線性化質粒同源區域在In-Fusion酶作用下形成重組質粒；
④將重組質粒導入受體細胞。
回答下列問題。
（1）過程①需要用到的酶是 耐高溫的DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶。過程③中，同源序列1與同源序列2中的堿基序列不同，這樣設計的好處是 防止目的基因反向連接，防止線性化質粒或目的基因自身環化防止目的基因反向連接，防止線性化質粒或目的基因自身環化。
（2）為保證擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依據 目的基因與質粒目的基因與質粒序列進行設計。
（3）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細胞。為檢測已轉化大腸桿菌的抗性效果，在含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的培養基上分別接種等量的已轉化大腸桿菌并培養相同時間，然后采用 稀釋涂布平板稀釋涂布平板法進行計數，若結果較真實值偏小，原因是 當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落。
（4）與傳統構建重組質粒的方法相比，In-Fusion技術的優勢有 不受限制酶酶切位點的限制；可以把目的基因插入任何位點；避免限制酶切割對質粒功能區的破壞不受限制酶酶切位點的限制；可以把目的基因插入任何位點；避免限制酶切割對質粒功能區的破壞。（至少答出兩點）
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】耐高溫的DNA聚合酶；防止目的基因反向連接，防止線性化質粒或目的基因自身環化；目的基因與質粒；稀釋涂布平板；當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落；不受限制酶酶切位點的限制；可以把目的基因插入任何位點；避免限制酶切割對質粒功能區的破壞
【解答】
【點評】
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