抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的推廣可有效減輕除草勞動(dòng)強(qiáng)度、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。圖1為抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的技術(shù)流程。

（1）構(gòu)建含除草劑抗性基因的表達(dá)載體，傳統(tǒng)的方法是目的基因通過(guò)

限制酶、DNA連接

限制酶、DNA連接

酶與載體進(jìn)行重組。另外，可通過(guò)

PCR

PCR

技術(shù)在目的基因兩側(cè)添加相應(yīng)限制酶識(shí)別序列，以便構(gòu)建表達(dá)載體。
（2）科研人員研發(fā)了新的DNA重組方法——無(wú)縫克隆In-Fusion技術(shù)，如圖2所示。In-Fusion酶能夠識(shí)別任何具有相同15bp末端序列的線(xiàn)性DNA分子并使其形成黏性末端，據(jù)此實(shí)現(xiàn)目的基因和載體的連接。和傳統(tǒng)方法比，無(wú)縫克隆In-Fusion技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是

插入位點(diǎn)不受限制酶識(shí)別序列限制，實(shí)現(xiàn)了目的基因在載體任意位點(diǎn)上的插入

插入位點(diǎn)不受限制酶識(shí)別序列限制，實(shí)現(xiàn)了目的基因在載體任意位點(diǎn)上的插入

。
①應(yīng)用以上方法構(gòu)建含有A基因和GUS基因的重組DNA分子時(shí)，首先獲得了圖3中的3種DNA分子，然后混合進(jìn)行In-Fusion反應(yīng)。
如果引物2上額外添加的片段與GUS基因e片段（圖中加粗表示）序列相同，那么引物1和引物4上額外增加的片段分別與載體中的片段（圖中加粗表示）

a（d）

a（d）

、

d（a）

d（a）

相同。完成重組反應(yīng)后，將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。
②為篩選成功轉(zhuǎn)入目標(biāo)重組DNA分子的菌落，可以選取引物

1、4

1、4

擴(kuò)增目的基因并電泳檢測(cè)。
（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時(shí)，常用含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織。由于愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，導(dǎo)致未成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。針對(duì)上述現(xiàn)象，可以在選擇培養(yǎng)基中同時(shí)加入

無(wú)色物質(zhì)K

無(wú)色物質(zhì)K

進(jìn)行篩選，其中周?chē)呐囵B(yǎng)基

顯

顯

（填“顯”或“不顯”）藍(lán)色的愈傷組織是轉(zhuǎn)化成功的，原因是

轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織中，GUS基因正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能催化培養(yǎng)基中的無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色；農(nóng)桿菌中的GUS由于含有內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列不能切除，不能正確表達(dá)，不能催化培養(yǎng)基中的無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色

轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織中，GUS基因正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能催化培養(yǎng)基中的無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色；農(nóng)桿菌中的GUS由于含有內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列不能切除，不能正確表達(dá)，不能催化培養(yǎng)基中的無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色

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