糖化酶是將淀粉轉化為葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經誘變處理后獲取的黑曲霉菌高產糖化酶基因導入畢赤酵母CS115（對氨芐青霉素不敏感）中，構建能直接利用淀粉的工程菌，該過程所用質粒（僅示部分結構）如圖1所示。質粒的外側鏈為a鏈，內側鏈為b鏈?；駻mp^r轉錄的模板鏈屬于b鏈的片段。三種限制酶的識別序列及切割位點見下表。請回答下列問題。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XbaⅠ
識別序列和切割位點（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

（1）為獲得糖化酶高產菌株，研究人員將經誘變處理后的黑曲霉菌接種到

淀粉

淀粉

含量高的培養基上，恒溫培養適宜時間后滴加碘液，挑選出透明圈（不產生藍色）直徑

較大

較大

的菌株，再進行復篩以及穩定性遺傳實驗。
（2）質粒復制的模板鏈是

a和b

a和b

（選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）鏈。高產糖化酶基因插入質粒后，其轉錄的模板鏈屬于

a

a

鏈的片段。
（3）構建高產糖化酶基因表達載體時，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需將溫度升高至65℃并保溫20min,目的是使

限制酶失活

限制酶失活

，從而終止酶切反應。圖2是高產糖化酶基因示意圖（僅示部分堿基），為使其能定向插入表達載體并成功表達，則PCR擴增時引物的堿基序列為

①④

①④

。
①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
（4）畢赤酵母GS115是一種組氨酸營養缺陷型微生物，自身不能合成生長必需的組氨酸，因此可利用

不含組氨酸

不含組氨酸

的基礎培養基（不含淀粉）初步篩選導入高產糖化酶基因表達載體的畢赤酵母GS115，再將篩選出的細胞轉接至含甲醇的培養液中進行發酵產酶性能測定。