回答用農桿菌轉化法獲得轉基因水稻的相關問題：
（1）選擇使用切割后形成不同粘性末端（識別并切割不同核苷酸序列）切割后形成不同粘性末端（識別并切割不同核苷酸序列）的兩種限制性核酸內切酶，對含目的基因的DNA片段和T質粒進行處理，然后用DNA連接酶連接形成重組質粒。兩種限制性核酸內切酶作用可以避免自身環化和反向連接（任意方向連接；連接方向不定）反向連接（任意方向連接；連接方向不定）。
（2）取氯化鈣（鈣離子）氯化鈣（鈣離子）處理過的農桿菌與重組質粒在離心管內進行混合等操作，使重組質粒進入農桿菌，完成轉化實驗。然后在離心管中加入液體培養基，置于搖床慢速培養一段時間，其目的是使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態。
（3）用含重組質粒的農桿菌和水稻細胞進行共培養，使攜帶目的基因的T-DNA片段移到水稻細胞并將其插入到水稻細胞的基因組（染色體）基因組（染色體）中，保證目的基因在水稻細胞中穩定和高效地表達。共培養后，外植體需要轉移到含有抗生素抗生素的培養基上進行脫菌培養，然后才能進行植物組織培養。
（4）獲得目的基因的水稻細胞經脫分化形成愈傷組織，再以適當配比的營養物質和生長調節劑適當配比的營養物質和生長調節劑誘導，直至再生出新植株。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：植物激素配比、愈傷組織繼代的次數，以及光照、溫度、水稻基因型（pH）光照、溫度、水稻基因型（pH）（答出2點即可）
【考點】基因工程在農牧、醫療、食品等方面的應用．
【答案】切割后形成不同粘性末端（識別并切割不同核苷酸序列）；反向連接（任意方向連接；連接方向不定）；氯化鈣（鈣離子）；使CaCl2處理過的農桿菌恢復細胞的正常狀態；基因組（染色體）；抗生素；適當配比的營養物質和生長調節劑；光照、溫度、水稻基因型（pH）
【解答】
【點評】
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發布：2024/4/20 14:35:0組卷：8難度：0.7
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1．學習以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變為終止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質的功能改變，引發相關疾病。約有10%～15%的人類基因相關遺傳疾病是由無義突變引發的。常規的基因治療是將正常基因的cDNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關的基因編輯工具）通過一定的方式導入人體靶細胞內，達到替代或修復缺陷基因、治療疾病的目的。導入基因插入位置不當、過高或過低表達，都可能會導致副作用。盡管基因編輯可以實現生理水平的基因表達，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發強烈的免疫反應仍然是巨大的挑戰。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點時不啟動翻譯終止而是繼續向后進行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關基因發生無義突變，產生終止密碼子UAG。研究者構建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設計的sup-tRNA表達載體（產生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導入細胞進行研究，發現與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進一步利用重組腺相關病毒作為載體將sup-tRNA導入患病小鼠模型中，實驗顯示能夠降低黏多糖過度積存，實現對該病癥的有效治療，其療效可以持續半年以上。
從整體來看，G418在促進跨越無義突變位點繼續翻譯時引入的氨基酸較為隨機，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內源tRNA穩態，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關治療中具有非常大的應用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關病毒與靶細胞膜上的發生識別，引發內吞，進入細胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細胞的催化合成其互補DNA鏈，再經過過程產生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內源tRNA穩態，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點繼續向后翻譯。實驗結果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進無義突變位點的翻譯方面更加有效，支持這一結論的依據是：。
（4）有文獻報道，已在近1000個不同的人類基因中發現了7500多個無義突變。常規的基因治療需要為每種疾病設計獨特的治療策略，這將是一項耗費驚人的項目。據此說明sup-tRNA的應用價值。發布：2025/1/3 8:0:1組卷：28引用：1難度：0.6 -
2．人類基因組計劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發布：2024/12/31 0:30:1組卷：115難度：0.7 -
3．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，自然界有些植物能產生幾丁質酶催化幾丁質水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入沒有抗性的植物體內，可增強其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結構，導致將其直接導入受體細胞中不能復制和表達。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質酶基因和質粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構建基因表達載體，DNA連接酶催化形成的化學鍵是。發布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7