In-Fusion技術是一項新型的無縫克隆技術。該技術關鍵是要在目的基因兩端構建與線性化質粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15～20 bp），然后用In-Fusion酶處理即可實現無縫連接。它的操作步驟大致為：①質粒線性化；②PCR擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因；③目的基因與線性化質粒同源區域在In-Fusion酶的作用下形成重組質粒；④將重組質粒導入受體細胞。
（1）過程①中需要用到的酶是 TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶。
（2）據圖分析，為保證擴增出所需的目的基因，引物A或引物B要依據 目的基因和質粒目的基因和質粒的堿基序列進行設計。過程②經過 33輪循環即可初步得到符合要求的目的基因片段。
（3）過程③中，同源序列1、2的堿基排序不同，這樣設計的好處是 防止目的基因反向連接；防止線性化質粒或目的基因的自身環化防止目的基因反向連接；防止線性化質粒或目的基因的自身環化。
（4）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細胞時，過程④需要用Ca2+處理大腸桿菌。為檢測已轉化大腸桿菌的抗性效果，在含氨芐青霉素的液體培養基中培養一段時間后，分別用顯微鏡計數法和 稀釋涂布平板稀釋涂布平板法進行計數，若計數結果分別是M、N，則致死率可用M-NM×100%表示，此結果較真實值偏大，原因是 在用稀釋涂布平板法計數時，當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落。在用稀釋涂布平板法計數時，當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落。。
M
-
N
M
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】TaqDNA聚合酶；目的基因和質粒；3；防止目的基因反向連接；防止線性化質粒或目的基因的自身環化；稀釋涂布平板；在用稀釋涂布平板法計數時，當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落。
【解答】
【點評】
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發布：2024/6/29 8:0:10組卷：15引用：2難度：0.5
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