香蘭素是從香莢蘭豆中提取的天然香料，因產量低而價格昂貴。近年來的生產實踐中常用擬無枝酸菌生產香蘭素，但香蘭素在香蘭素脫氫酶的作用下會進一步降 解。科研人員擬通過CRISPR-Cas9系統（由一條單鏈向導RNA和核酸內切酶Cas9組成），敲除擬無枝酸菌的香蘭素脫氫酶基因（VDH），以提高香蘭素的產量。圖1是選擇VDH基因中特定位點進行切割的示意圖，圖2是設計CRISPR-Cas9系統向導RNA中的識別序列，并構建可用于敲除VDH 基因的質粒的主要過程。請回答下列問題：
（1）核酸內切酶Cas9可催化 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵鍵的水解。利用CRISPR-Cas9系統敲除VDH基因的內部大片段屬于 基因突變基因突變（變異類型）。
（2）圖2中，過程A使用的4種引物序列如下：
引物 1 5'-GAGTCGAAGCTTTTTTTGAGAGCTCGTCCCACGACG-3'
引物 2 5'-GGTCGTTGATGTCCACTTCTCGTCGTCGAG-3'
引物 3 5'-AGAAGTGGACATCAACGACCAGACGGTCAAC-3'
引物 4 5'-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGAGCACCTGGAGAAGG-3'
①利用PCR1和PCR2分別擴增VDH基因的部分片段，獲得VDH基因上游和下游同源臂（VDH-F和VDH-R），這兩個PCR不能放在同一系統中同時進行，這是因為 引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應系統時它們會發生結合而失去作用，導致擴增完整的VDH基因引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應系統時它們會發生結合而失去作用，導致擴增完整的VDH基因。
②PCR3反應系統中加入的引物有 引物1和引物4引物1和引物4，此外還應加入模板DNA（VDH-F和VDH-R）、Mg2+、緩沖液、Taq酶、4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等Taq酶、4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等等，適宜條件下擴增得到VDH-F和VDH-R的融合片段。
（3）圖2中，完成過程B需要加入的酶有 HindIII和DNA連接酶HindIII和DNA連接酶。將質粒2導入擬無枝酸菌前，用 Ca2+（或CaCl2）Ca2+（或CaCl2）處理使菌株處于感受態，導入后將菌液利用 稀釋涂布平板（或平板劃線法）稀釋涂布平板（或平板劃線法）法接種到添加 安普霉素安普霉素的選擇培養基中，培養獲得多株轉化菌株。
（4）通過篩選獲得的轉化菌株需要從個體水平進行生產性能測試。請寫出基本思路 將菌株接種到適合培養基中，置于溫度等適宜條件下培養，一段時間后取樣檢測培養液中香蘭素的濃度將菌株接種到適合培養基中，置于溫度等適宜條件下培養，一段時間后取樣檢測培養液中香蘭素的濃度。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】磷酸二酯鍵；基因突變；引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應系統時它們會發生結合而失去作用，導致擴增完整的VDH基因；引物1和引物4；Taq酶、4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等；HindIII和DNA連接酶；Ca2+（或CaCl2）；稀釋涂布平板（或平板劃線法）；安普霉素；將菌株接種到適合培養基中，置于溫度等適宜條件下培養，一段時間后取樣檢測培養液中香蘭素的濃度
【解答】
【點評】
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發布：2024/4/20 14:35:0組卷：20引用：2難度：0.6
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3．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得。基因文庫包括和。
（2）生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的。
（3）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有和，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是。當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是。
（4）提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（5）若獲得的轉基因植株（幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中）抗真菌病的能力沒有提高，根據中心法則分析，其可能的原因是。發布：2025/1/5 8:0:1組卷：2引用：2難度：0.6