Gateway克隆技術(shù)是一種快速，高效地構(gòu)建基因表達(dá)載體的方法。這種方法基于噬菌體可以和大腸桿菌DNA的特定位點(diǎn)發(fā)生互換的特點(diǎn)設(shè)計(jì)，不用依賴(lài)限制酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和克隆酶，將目的基因克隆到其它的受體載體上。如圖1所示，Gateway克隆技術(shù)依賴(lài)于BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，通過(guò)BP反應(yīng)將目的基因連接到質(zhì)粒1上，獲得克隆質(zhì)粒2，再通過(guò)LR反應(yīng)將目的基因連接到載體質(zhì)粒3上，獲得表達(dá)載體。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）構(gòu)建的基因表達(dá)載體除含有圖示的目的基因和標(biāo)記基因外，還必須有

啟動(dòng)子和終止子

啟動(dòng)子和終止子

。
（2）為構(gòu)建基因表達(dá)載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PC特異性擴(kuò)增目的基因，用于擴(kuò)增目的基因的引物需滿(mǎn)足的條件是

能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)

能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)

，為使PCR產(chǎn)物能參與后續(xù)交換，需要分別在2種引物上添加相應(yīng)的attB1和attB2序列，該序列應(yīng)添加在引物的

5′端

5′端

（填3′端”或5′端”）。
（3）BP反應(yīng)中，將帶有atB1和attB2序列的目的基因與質(zhì)粒1混合，加入BP克隆酶，atB和attP位點(diǎn)之間會(huì)發(fā)生互換。該反應(yīng)體系中可能含有未交換的質(zhì)粒1和交換后的質(zhì)粒2，為從體系中篩選出質(zhì)粒2，用混合體系中的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化用Ca²⁺處理后的大腸桿菌，并涂布到含有青霉素的平板上。理論上，在平板上長(zhǎng)出菌落的大腸桿菌中含有的質(zhì)粒即為質(zhì)粒2，理由是

質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖；而質(zhì)粒1含有ccdB基因，其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖

質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖；而質(zhì)粒1含有ccdB基因，其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖

。
（4）除本題所用接種方法外，也可以采用

平板劃線

平板劃線

法進(jìn)行接種，若培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示，接種環(huán)節(jié)需灼燒接種環(huán)

5

5

次。
（5）若將（3）中獲得的含質(zhì)粒2的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從物理性質(zhì)考慮，一般采用

液體

液體

培養(yǎng)基。