膠原蛋白在維持器官、組織、細胞等方面發揮著關鍵性作用，傳統提取方法得到的膠原蛋白成分復雜，還可能攜帶動物病毒等。科學家將合成膠原蛋白的基因kit導入大腸桿菌構建基因工程菌，過程如圖1所示。請據圖回答下列問題：
（1）圖中①過程需要使用 逆轉錄逆轉錄酶，②過程需要用到的酶有 限制酶限制酶和 DNA連接酶DNA連接酶，前者可以切斷兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
（2）用圖中方法得到的kit基因較少，可以采用PCR技術進行擴增，已知kit基因的部分序列如下：
5'-CGGG ATCCALLAGAATTCCG-3'
3'-GCCCTAGGTLLTCTTAAGGC-5'
根據上述序列設計引物為 BCBC（填字母），以 BamHⅠ和EcoRⅠBamHⅠ和EcoRⅠ（填限制酶）進行雙酶切kit基因與質粒pET-28a（+），為了實現目的基因與運載體的連接，則需要在引物的 5’5’端添加限制酶識別序列。
A．5'-GCCCTAGGT-3'B．5'-CGGAATTCT-3'
C．5'-CGGGATCCA-3'D．5'-GCCTTAAGA-3'
（3）為了使重組質粒更易進入大腸桿菌，可以用 Ca2+Ca2+處理大腸桿菌，若要檢測kit基因是否在大腸桿菌體內發揮作用，首先需要檢測大腸桿菌的 RNARNA（選填“DNA”或“RNA”）。
（4）雙酶切kit基因，與質粒pET-28a（+）長度為170bp片段進行置換，構建重組質粒pET-28a（+）-kit,上述兩種質粒在HindⅢ酶切后片段長度如下表所示，
| 質粒類型 | pET-28a（+） | pET-28a（+）-kit |
| HindⅢ酶切片段 | 1000bp、2550bp | 1000bp、2000bp、700bp |
320bp
320bp
，由此判定kit基因上有2個HindⅢ酶切位點，原因是 pET-28a（+）原有的兩個HindⅢ位點被目的基因置換走一個后，得到環狀的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段
pET-28a（+）原有的兩個HindⅢ位點被目的基因置換走一個后，得到環狀的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段
。（5）菌液PCR是直接以菌體熱解后的DNA為模板、以目基因兩端序列為引物進行擴增的方法，根據凝膠電泳結果可初步鑒定菌落是否含有目的基因。對構建的基因工程菌進行菌液PCR驗證，根據初步驗證的結果提取大腸桿菌的質粒進行雙酶切再驗證，結果如圖2所示。分析可知，基因工程菌的構建
是
是
（選填“是”或“否”）成功，原因是 菌落PCR與質粒雙酶切均獲得大小約為320bp的基因片段
菌落PCR與質粒雙酶切均獲得大小約為320bp的基因片段
。【答案】逆轉錄；限制酶；DNA連接酶；BC；BamHⅠ和EcoRⅠ；5’；Ca2+；RNA；320bp；pET-28a（+）原有的兩個HindⅢ位點被目的基因置換走一個后，得到環狀的pET-28a（+）-kit仍然被HindⅢ限制酶切割成3段；是；菌落PCR與質粒雙酶切均獲得大小約為320bp的基因片段
【解答】
【點評】
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