某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合表達蛋白M和tag標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題：
（1）目的基因的擴增：
①提取真菌細胞 RNARNA，經逆轉錄獲得cDNA，進一步獲得基因m片段。
②為了獲得融合tag標簽的蛋白M，設計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導致 蛋白M上不含tag標簽蛋白M上不含tag標簽。
③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴增，下列敘述正確的有 BCBC。
A．Taq酶最適催化溫度范圍為50～60℃
B．與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C．兩條子鏈的合成一定都是從5′端向3′端延伸
D．PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性
（2）重組質粒的構建：
①將SmaⅠ切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進 黏性末端堿基配對黏性末端堿基配對，形成A-m結合體。將A-m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及 DNA連接DNA連接酶等，完成質粒的環化。
②若正確構建的重組質粒A-m仍能被SmaⅠ切開，則SmaⅠ的酶切位點可能在 基因m的連接處、基因m的內部基因m的連接處、基因m的內部。
（3）融合蛋白的表達：
①用含有尿嘧啶的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒A-m,然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是 受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落。
②若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明 融合基因表達（或融合基因正確解碼）融合基因表達（或融合基因正確解碼），后續實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】RNA；蛋白M上不含tag標簽；BC；黏性末端堿基配對；DNA連接；基因m的連接處、基因m的內部；受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有URA3基因可以長成菌落；融合基因表達（或融合基因正確解碼）
【解答】
【點評】
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發布：2024/4/20 14:35:0組卷：308引用：4難度：0.5
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