酯酶結合熒光分析法可對有機磷和氨基甲酸酯類農藥進行檢測，某研究院利用轉基因技術獲得一種催化效率高、農藥敏感性強的微生物酯酶。

（1）人工合成酯酶基因后通過PCR技術可實現擴增，為該過程提供能量的是

dNTP

dNTP

；還需要設計兩種引物，設計引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的

3’端

3’端

開始連接脫氧核苷酸。為方便構建重組質粒，需要在引物的5’端設計

HindⅢ、EcoRⅠ

HindⅢ、EcoRⅠ

酶的識別序列。某質粒圖譜和目的基因的序列如圖所示，應選擇引物

①③

①③

（填數字）。（①-④中加粗表示識別序列前的保護堿基，增強上述酶與目的基因的結合）
①5′-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3′
②5′-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3′
③5′-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
④5′-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3′
（2）若提取高產酯酶野生菌的基因組DNA，用設計的引物和合適的條件進行PCR，其產物可用

電泳

電泳

鑒定。結果發現有目的基因以外的雜帶存在，分析可能原因是：

在基因組DNA中有其他引物結合的位點/引物特異性不強/引物過短

在基因組DNA中有其他引物結合的位點/引物特異性不強/引物過短

。解決措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“內部”或“上、下游”）重新設計引物進行PCR。

限制酶	識別序列與切割位點	限制酶	識別序列與切割位點
PstⅠ	5′-CTGCA↓G-3′	NdeⅡ	5′-↓GATC-3′
HindⅢ	5′-A↓AGCTT-3′	EcoRⅠ	5′-G↓AATTC-3′
DpnⅡ	5′-↓GATC-3′	AluⅠ	5′-AG↓CT-3′

（3）將PCR產物和質粒用限制酶酶切，酶切產物純化后，用

DNA連接酶

DNA連接酶

連接，連接產物導入大腸桿菌前需用

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

Ca²⁺（氯化鈣溶液）

處理大腸桿菌，使其處于感受態。
（4）將目的蛋白與某些標簽融合表達形成含標簽的融合蛋白，實現增溶、防降解、促進分泌、便于純化和檢測等功能。6×His-Tag（組氨酸標簽）含有的咪唑基團選擇性地結合在已固定于層析介質的Ni²⁺、Co²⁺等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競爭性洗脫結合在介質上的His標簽蛋白。據此推測，6×His-Tag的作用之一是

便于純化目的蛋白

便于純化目的蛋白

。