重組人纖溶酶原激活劑（hPA）能夠高效特異性地溶解血栓，目前已培育成功rhPA轉基因兔，作為乳腺生物反應器批量生產藥物。某科研團隊構建的PCL25/hPA重組質粒如圖1所示（該質粒以β-casein作為調控序列，以CMV為啟動子，圖1中SadⅠ、XhoⅠ、NotⅠ所在位置表示相關限制酶切點），圖2為培育rhPA轉基因兔時用的乳腺特異性表達載體及PCR檢測原理圖（PCR-F、PCR-R為引物序列）。請回答下列問題：

（1）據圖1推測，PCL25/rhPA重組質粒是在PCL25質粒的

XhoⅠ

XhoⅠ

限制酶切位點處插入化學合成的rhPAcDNA片段構建而成。rhPA基因上游的CMV能被

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識別并結合，從而開啟轉錄過程。
（2）為獲得圖2的乳腺特異性表達載體需用

SalⅠ和NotⅠ

SalⅠ和NotⅠ

切割PCL25/rhPA重組質粒使之線性化。PCR-F和PCR-R設計時依據的是

CMV和rhPA基因的部分脫氧核苷酸序列

CMV和rhPA基因的部分脫氧核苷酸序列

序列。
（3）對實驗得到的1～6號仔兔進行PCR及產物檢測，得到圖3所示結果，則成功導入rhPA基因的仔兔有

2、3、5、6

2、3、5、6

。（注：M道條帶可作為雙鏈線狀DNA分子量大小的參照，7道為顯微注射片段PCR擴增產物作陽性對照）
（4）生長激素（GH）可促進動物細胞增殖和乳腺生長發育及維持泌乳。研究人員將GH基因導入rhPA單轉基因兔體內，獲得rhPA/GH雙轉基因兔，以期提高兔乳清中的rhPA表達量。
①完成下列表格：

實驗目的	簡要操作過程
顯微注射用基因片段的準備	將PCL25/GH質粒雙酶切而線性化，電冰分離不同大小分子量的基因片段，回收真核基因片段待用
對兔進行 超數排卵 超數排卵 和同期發情處理	選取3只未發情的rhPA單轉基因兔作為供體（標號a、b、c），適量注射FSH/hCG（兩種促性腺激素），與正常公兔配種，在母兔的 輸卵管 輸卵管 （填部位）形成受精卵。在供體兔配種的同時，選取成年健康新西蘭母兔作為受體，耳緣靜脈注射適量hCG。
雙轉基因兔的制備	將顯微注射基因片段導入受精卵的原核內，適宜條件培養，胚胎移植。
轉基因兔的整合篩選	無菌剪取新生仔兔的耳尖組織少許，提取基因組。針對rhPA和GH兩種基因，設計 2 2 對引物進行PCR檢測。PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定條帶大小是否正確。
rhPA含量測定	分別測定 rhPA單轉基因兔和rhPA/GH雙轉基因兔 rhPA單轉基因兔和rhPA/GH雙轉基因兔 乳清中的rhPA的表達量。

②分析實驗結果

樣本	供體兔a	供體兔b		供體兔c
rhPA表達水平（μg?mL-1）	42.2	42.8		15.2
樣本	雙轉基因兔a1	雙轉基因兔a2	雙轉基因兔b1	雙轉基因兔c1
rhPA表達水平（μg?mL-1）	432	444	636	248

（注：雙轉基因兔a1、2親本來源為供體兔a,雙轉基因兔b1親本來源為供體兔b,雙轉基因兔c1親本來源為供體兔c）
實驗結果表明，

rhPA/GH雙轉基因兔乳腺表達rhPA水平明顯高于rhPA單轉基因兔，GH可協同促進rhPA在轉基因兔乳腺中的高效表達

rhPA/GH雙轉基因兔乳腺表達rhPA水平明顯高于rhPA單轉基因兔，GH可協同促進rhPA在轉基因兔乳腺中的高效表達

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