糖尿病是全球患病率最高的慢性病之一，胰島素是最主要的治療藥物，需求量非常大。研究者利用圖中質粒構建重組DNA分子并導入大腸桿菌，獲得生產胰島素的工程菌

注：EcoRⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ為不同的限制酶，LacZ基因能編碼產生β-半乳糖苷酶，可催化無色物質X-gal 產生藍色物質使菌落呈藍色，否則為白色，以顏色不同為依據直接篩選含重組DNA分子菌體的方法稱為“藍白斑”法。
回答下列問題：
（1）獲取目的基因。提取胰島β細胞中的總RNA，通過一定方法分離純化出mRNA，經逆轉錄得到

cDNA

cDNA

然后設計引物利用PCR擴增胰島素基因。選擇胰島β細胞提取RNA的原因是

胰島β細胞選擇性表達胰島素基因

胰島β細胞選擇性表達胰島素基因

。
（2）構建重組DNA分子。為使所得的胰島素基因能按照正確的方向與載體連接，利用PCR 擴增目的基因時，在目的基因的左右端分別添加

SmaⅠ、BamHⅠ

SmaⅠ、BamHⅠ

限制酶的識別序列，且識別序列應添加在引物的

5'

5'

（填“3′”或“5′”）端。
（3）導入、篩選和鑒定。
①將大腸桿菌放在低溫、低濃度的CaCl₂溶液中，使

細胞膜

細胞膜

的通透性改變，成為感受態細胞，提高轉化效率。
②“藍白斑”法是基因工程中常用的篩選方法。為了達到篩選目的，根據所用載體質粒的遺傳特性，受體大腸桿菌需具備

氨芐青霉素

氨芐青霉素

敏感和

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶

缺陷等特征。篩選時，將轉化后的菌液經稀釋后用涂布分離法接種于含

氨芐青霉素和X-gal

氨芐青霉素和X-gal

的培養基，經培養后挑取白色的單菌落，即為目標工程菌。
③為更加精準地鑒定受體細胞中是否轉入目的基因，可采用

核酸分子雜交

核酸分子雜交

和PCR等方法，PCR 后可用凝膠電泳鑒定PCR產物。下列屬于影響DNA遷移速率因素的是

ABCD

ABCD

（A．DNA 分子大小 B．DNA分子形狀 C．所帶電荷情況 D．凝膠濃度）
（4）驗證胰島素功能。為驗證胰島素的降血糖功能，某生物小組以小鼠的活動狀況為觀測指標設計實驗。
實驗材料：正常小鼠若干、注射器、胰島素溶液、葡萄糖溶液、生理鹽水等
請完善實驗步驟：
①給每只生理狀況相似的正常小鼠

注射等量適量的胰島素溶液

注射等量適量的胰島素溶液

，觀察并記錄小鼠的活動狀況。
②等小鼠出現活動減少、甚至昏迷等

低血糖

低血糖

癥狀，將小鼠隨機均分為A、B兩組。
③A組小鼠

注射等量適量葡萄糖溶液

注射等量適量葡萄糖溶液

，B組小鼠

注射等量生理鹽水

注射等量生理鹽水

，一段時間后，觀察小鼠活動狀況。
結果及結論：A組小鼠癥狀得到緩解，B組小鼠狀況無變化，證明胰島素具降血糖功能。